ISOLASI PLASMID, SPEKTROFOTOMETRI, dan ELEKTROFORESIS

Pendahuluan

Latar belakang

Plasmid  adalah molekul DNA  sirkuler  berukuran  relatif  kecil  di  luar  kromosom  yang  terdapat  di  dalam  sel  prokariot, khususnya  bakteri  dan  sel  eukariotik  tingkat  rendah . DNA plasmid berukuran lebih kecil dari DNA kromosom dan dapat bereplikasi sendiri. Plasmid biasanya digunakan dalam  teknologi DNA  rekombinan menggunakan E. coli  sebagai host, sehingga dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen  tertentu  yang  diinginkan  ke  dalam  suatu  sel  inang. Gen-gen  tersebut  selanjutnya akan mengekspresikan  produk  komersial  tertentu  seperti  insulin,  interferon,  dan  berbagai enzim (Stanfield 1996). Penggunaan plasmid dalam DNA rekombinan dilakukan karena plasmid memiliki tiga region yang berperan penting untuk DNA kloning, yaitu,  replication origin, marker yang memungkinkan  adanya  seleksi  (biasanya  gen  resisten  antibiotik)  dan  region  yang mampu disisipi oleh fragmen DNA dari luar (Lodish et al).

Elektroforesis  DNA  merupakan  teknik  untuk  memisahkan  sampel  DNA  berdasarkan   ukuran  (berat  molekul)  dan  struktur  fisik  molekulnya. Posisi molekul yang terpisah pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk pemisahan protein dan asam nukleat (DNA). Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekulmolekul berdasarkan muatannya. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif . Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah  laju  migrasinya.  Berat  molekul  suatu  fragmen  DNA  dapat  diperkirakan  dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker)  yang  telah  diketahui  ukurannya ( ).

Spektrofotometri sinar UV digunakan untuk mengukur tingkat kemurnian DNA hasil isolasi. Spektrofotometri merupakan metode analisis yang didasarkan pada absorpsi radiasi elektromagnet. Keuntungan utama pemilihan metode spektrofotometri bahwa metode ini memberikan metode sangat sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat kecil.

Tujuan

Mengetahui dan Mengisolasi plasmid untuk vektor kloning. Mengetahui dan dapat menghitung konsentrasi DNA/ RNAdengan spektrofotometri; dapat menganalisa kualitas DNA/RNA, dan mengetahui cara mendeteksi DNA dengan gel agarose.

Hasil Pengamatan

Tabel 1 hasil spektrofotometri plasmid

Kelompok Panjang gelombang (λ) Konsentrasi (ng/µl) Kemurnian
230 260 280 Aktual Teori (hitungan) Aktual Teori (hitungan)
1 1,538 2,002 1,287 20020 15015 1,096 1,555556
2 1,511 1,978 1,740 19780 14835 1,137 1,136782
3 1,501 1,971 1,731 19710 14782,5 1,139 1,138648
4 1,507 1,671 1,668 19710 12532.5 1,182 1,001799
5 1,494 1,965 1,693 19650 14737,5 1,161 1,160662
6 1,500 1,979 1,790 19790 14842,5 1,106 1,105587
7 1,532 1,991 1,803 19910 14932,5 1,104 1,104271
8 1,512 1,995 1,821 19950 13657,5 1,096 1,095552
9 1,495 1,972 1,811 19720 14790 1,089 1,088901
10 1,547 2,011 1,872 20110 15082,5 1,072 1,074252

Contoh perhitungan:

Kelompok 1

Konsentrasi DNA

Diketahui:       λ260                             = 2,002 Å

Konstanta DNA          = 50 mg/ml

Faktor pngenceran(FP) = 150

FP= 1500 ml

10 ml

[DNA] = λ260 x konstanta DNA x FP

= 2,002 Å x 50 mg/ml x 150 ml

= 15015

Kemurnian DNA

Diketahui:       λ260    = 2,002 Å

λ280    = 1,287 Å

Kemurnian DNA         = λ260 / λ280

= 2,002 Å / 1,287 Å

= 1,555556 Å

Contoh perhitungan

Kelompok 1

Ukuran DNA total

Diketahui: Ukuran marker 1 = 10 ng              Pita 1= dekat ke marker 3             = 50 ng

Ukuran marker 2 = 30 ng              Pita 2 = lebih besar dari marker 3 = 100 ng

Ukuran marker 3 = 50 ng

Ukuran DNA total = pita1 + pita 2

10 µl

= 50 ng + 100ng

10 µl

= 15  ng/µl

Pembahasan

Keberhasilan isolasi DNA plasmid dapat diketahui dengan cara spektrofotometri dan elektroforesis. Dengan spektrifotometri tingkat kemurnian DNA dapat diukur. Dengan elektroforesis ukuran DNA dapat diketahui dengan membandingkannya dengan DNA marker yang sudah diketahui konsentrasinya. Berdasarkan hasil spektrofotometer nilai kemurnian tertinggi yaitu kelompok 1 dengan nilai 1,555556. Sementara konsentrasi tertinggi yaitu kelompok 10 dengan nilai konsentrasi 20110. Berdasarkan hasil pengamatan secara umum isolasi DNA plasmid berhasil dilihat dari pita-pita DNA yang terbentuk pada elektroforesis. Berdasarkan data kelompok 1  dan  kelompok 4 ada perbedaan antara nilai kemurnian aktual dan kemurnian teori, sementara kelompok lainnya nilai kemurnian aktual merupakan pembulatan nilai kemurnian teori atau hitungan secara manual. Tingginya kemurnian DNA data kelompok 1 disebabkan selisih yang cukup jauh antara panjang gelombang 260Å dan 280Å. Konsentrasi dan kemurnian aktual merupakan nilai yang tertera saat proses spektrofotometri. Konsentrasi dan kemurnian teori adalah hasil hitungan manual.

Secara umum hasil pengamatan  isolasi DNA plasmid dengan elektroforesis berhasil,  dilihat dari pita-pita DNA yang terbentuk pada elektroforesis. Hampir semua kelompok terbentuk pita-pita DNA hasil isolasi pada sumur-sumur gel agarose, kecuali dua kelompok yaitu kelompok pada sumur keempat dan sumur kesembilan. Pita-pita DNA tidak terbentuk seperti seharusnya, ada beberapa kemungkinan yang menyebabkan hal tersebut dapat terjadi diantaranya DNA dimasukan dalam sumur dengan tidak hati-hati sehingga DNA hilang karena larut. Pita-pita DNA yang terbentuk seharusnya terdiri atas 4 pita  yaitu, open circular, linear, circular dan supercoiled. Setiap DNA tersebut mempunyai bentuk berbeda-beda sehingga kecepatan migrasinyapun berbeda. Hal tersebut menyebabkan letak DNA tersebut berurutan sesuai dengan kecepatan laju migrasinya. DNA supercoiled memiliki bentuk yang membuatnya fleksibel untuk bergerak.

Hasil spektrofotometri kelompok kami memiliki nilai kemurnian yang tinggi, nilai konsentrasinya juga tinggi sebanding dengan nilai kemurniannya. Nilai kemurnian yang baik yaitu ≥ 1,8. Nilai kemurnian suatu bahan ditentukan dengan nisbah A260/280 yang menyatakan kualitas DNA tersebut. Selain kemurnian, keutuhan (integritas) DNA juga merupakan parameter lainnya yang sering digunakan dalam pengujian kualitas DNA (Isda 2008). Sementara untuk elektroforesis pita-pita DNA terbentuk membuktikan bahwa isolasi plasmid berhasil. Pita DNA yang terbentuk berjumlah 2 dengan ukuran yang cukup besar. Berdasarkan hasil hitungan ukuran total DNA yang didapat kira 15ng/ml.

Simpulan

Secara umum proses isolasi DNA plasmid berhasil. Pada pengamatan elektroforesis hampir semua sumur pada elektroforesis membentuk pita-pita DNA. Nilai kemurnian DNA secara umum kecil karena tidak mencapai 1,8 yang merupakan nilai kemurnian yang baik.

Daftar Pustaka

Anonim, 1979. Farmakope Indonesia Ed. III. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta.

Anonim. 2009. Elektroforesis Protein. http://inherent.brawijaya.ac.id/biomol/materi/Lecture14.pdf

Anonim. 2010. Elektroforesis. http://www1.qiagen.com/literature/qiagennews/0100/Practical_Hints.pdf

Isda N M, Musliar Kasim, Mansyurdin. 2008. Kloning dan karakterisasi gen penyandi inhibitor proteinase dari kulit buah kakao. Menara Perkebunan 76(2): 83-92

Lodish. Berk. Matsudaira. Kaiser. Krieger. Scott. Zipursky. Darnell. Molecular Cell Biology fifth Edition.

Stanfield WD, Jaime SC, Raul JC. 1996. Molecular and Cell Biology. New York: Mc Graw-Hill.

Tjahjoleksono A. 2009. Plasmid. http://web.ipb.ac.id/tpb/files/materi/genetika/dnarekombinan/plasmid.pdf

Pembahasan

Teknik elusi atau disebut juga teknik preparasi gel elektroforesis merupakan tekni isolasi fragmen DNA plasmid dari gel agarosa. Tujuan dilakukannya teknik elusi adalah untuk mengisolasi fragmen tunggal DNA yang diinginkan misalnya dalam sebuah penelitian dikatakan teknik ini digunakan untuk mengisolasi protein spesifik dalam intestin suatu organisme (Fitriyah 2006). Dalam isolasi fragmen tunggal DNA biasanya fragmen DNA tersebut digunakan sebagai pelacak untuk deteksi DNA lain atau dicangkokkan ke fragmen DNA lain dalam rekayasa genetika. Fragmen DNA yang diisolasi dengan teknik ini dalam praktikum yang dilakukan  yaitu fragmen DNA yang didapat dari hasil pemotongan DNA dengan enzim restriksi pada praktikum sebelumnya. Senyawa yang digunakan dalam praktikum ini yaitu berupa larutan penyangga elusi yang terdiri dari Tris pH 7.5, SDS (Sodium Dodecyl Sulfate), H2O atau TE. Fungsi dari larutan penyangga elusi ini yaitu untuk menyesuaikan kondisi yang tepat bagi enzim agar bekerja secara maksimal dan menjaga keseimbangan sel agar tidak lisis (Lodish et al 1995). SDS merupakan suatu detergen fungsinya yaitu membantu proses pelisisan sel dengan cara melarutkan fosfolipid pada membran sel dan mendenaturasi protein sehingga membran sel akan mengalami kerusakan (Brown (1991).

Pada gambar hasil pengamatan dapat dilihat bahwa hanya satu sumur yang berhasil yaitu sumur ke empat yang merupakan fragmen DNA plasmid kelompok empat sementara itu sumur kelompok satu tidak berhasil demikian halnya dengan sumur-sumur lainnya. Kemungkinan tidak berhasilnya isolasi diakibatkan oleh beberapa hal misalnya gel agarosa yang dipotong dari hasil restriksi sebelumnya tidak mengandung fragmen DNA yang hendak diisolasi. Pemotongan tidak pada tempat yang tepat yang mengandung DNA. Saat pencacahan terjadi kontaminasi, dan kemungkinan lain adalah karena ukuran DNA yang sangat kecil juga tidak terihat hilang saat proses isolasi dilakukan, misal saat penyaringan dengan nylon hybond DNA tidak tersaring.

Daftar Pustaka

Brown, T.A. 1991. Pengantar Cloning Gen. Yogyakarta: Yayasan Essentia Medica.

Fitriyah Juliani. 2006. Isolasi protein spesifik intestine cacing Mecistocirrus digitatus dewasa dengan teknik elusi. [Skripsi]. Surabaya: UNAIR Press

Lodish H et al.. 1995. Molecular Cell Biology. New York: Scientific American Books.

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Tubuh hewan secara morfologi terdiri atas unit sel, dan masing-masing sel dengan mengadakan kesatuan dengan adanya substansi antar sel. Di dalam tubuh hewan sel-sel ini terdapat dalam kelompok yang secara struktural dan fungsional berbeda dengan kelompok sel yang lain. Kelompok-kelompok sel-sel tersebut dikenal dengan jaringan (Sumardi, 2002). Preparat awetan jaringan hewan adalah salah satu media pembelajaran Biologi yang sangat efektif. Dengan latar belakang seperti di atas, maka diharapkan kita dapat mengamati dan melihat preparat dengan menggunakan metode paraffin dengan pewarnaan tunggal (Anonim, 2004).

Metode parafin termasuk metode irisan yang merupakan metode rutin atau standar. Metode ini sekarang banyak digunakan, karena hampir semua macam jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metode ini. Kebaikan-kebaikan metode ini ialah irisan dapat jauh lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau metode seloidin. Dengan menggunakan metode beku, tebal irisan rata-rata di atas 10 mikron, tetapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapati rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah, bila menggunakan metode ini. Prosesnya jauh lebih cepat dibandingkan metode seloidin. Kejelekannya ialah jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan metode ini.

Urutan kerja pembuatan sediaan irisan dengan metode paraffin sebagai berikut: fiksasi: pencucian (washing); dehidrasi; penjernihan (clearing); infiltrasi parafin; penanaman (embedding); penyayatan (section); penempelan (affiksing); deparafinasi; pewarnaan (staining); penutupan (mounting). Setelah hewan dibunuh, segera diambil organ-organ yang diperlukan untuk segera difiksasi. Kalau diperlukan, sebelum difikasisi dicuci dulu dengan larutan garam fisiologis.

Tujuan

Praktikum kali ini bertujuan untuk membuat sediaan sayatan organ hewan.

HASIL

Table hasil pengamatan sediaan sayatan organ hewan

No Nama organ gambar literatur

1

Tyroid tikus

Tyroid tikus

2

Testis katak

Testis katak

PEMBAHASAN

Praktikum kali ini adalah mempelajari cara penyiapan preparat dengan metode sediaan sayatan menggunakan metode parafin. Metode ini merupakan metode yang lazim digunakan dalam penyiapan spesimen histologi. Dengan metode ini spesimen disayat setipis mungkin, diwarnai dan dijadikan spesimen yang dapat bertahan lama.  Metode ini meliputi sejumlah proses yang harus dilakukan, mulai dari proses fiksasi, dehidrasi, infiltrasi, penanaman dalam parafin, penyiapan parafin blok, penyayatan, pewarnaan dan penutupan specimen dengan kaca penutup. (Gunarso 1986). Kelebihan metode ini adalah irisan dapat lebih tipis daripada menggunakan metode lain. Misalnya dengan menggunakan metode beku, tebal irisan rata-rata di atas 10 mikron, tetapi dengan metode parafin tebal irisan dapat mencapati rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah, bila menggunakan metode ini, selain itu prosesnya jauh lebih cepat.

Langkah pertama dalam menyiapkan materi segar untuk pengamatan mikroskopis adalah fiksasi. Fiksasi juga merupakan langkah awal yang penting dalam membuat sediaan utuh maupun sediaan sayatan. Tujuan fiksasi adalah menghentikan proses metabolisme secara cepat, mencegah kerusakan jaringan, mengawetkan komponen-komponen sitologis dan histologis, mengawetkan keadaan sebenarnya, mengeraskan materi-materi yang lembek sehingga  akan terjadi koagulasi protoplasma maupun elemen-elemen di dalam protoplasma, jaringan dapat diwarnai sehingga bagian-bagian dari jaringan dapat mudah dikenali. Secara ringkas fiksasi terdiri dari dua proses yang jelas, yaitu mematikan dan menetapkan. (Gunarso 1986).

Suatu fiksatif dikatakan baik jika mempunyai kemampuan untuk mengendapkan kromatin, mempunyai kemampuan untuk mematikan dengan segera, mempunyai kemampuan untuk mangautolisis protein, mencegah terjadinya dekomposisi yang dilakukan oleh bakteri, dan dapat menciptakan keadaan pH yang sesuai untuk jaringan yang telah difiksasi. (Gunarso 1986).

Formal saline merupakan cairan fiksatif yang umum digunakan, formulanya mengandung formalin dan garam klorida, sedangkan larutan Bouine dalam formulanya mengandung asm pikrat dan asam asetat yaitu jenis-jenis asam yang direkomendasikan akan memberikan hasil yang memuaskan pada pewarnaan yang dilakukan. (Gunarso 1986).

Larutan yang digunakan untuk fiksasi dalam praktikum ini adalah larutan Bouine yang merupakan fiksatif standard. Komposisi larutan Bouine adalah larutan asam pikrat jenuh 75cc, formalin komersial 20cc, asam asetat glacial 5cc. Asam asetat sangat baik menembus jaringan dan berperan dalam diferensial optik, juga sangat baik dalam memfiksasi inti. Namun asam asetat cenderung menyebabkan jaringan membengkak, melarutkan atau merusak elemen-elemen di sitoplasma. Formalin menyebabkan terjadinya perubahan struktur dari molekul-molekul protein. Asam pikrat merupakan jenis asam organik yang sangat efektif dalam meningkatkan jenis fiksatif. Sehingga jika ketiganya dipadukan slam larutan Bouine didapat hasil yang baik dalam pewarnaan. (Gunarso 1986). Setelah proses fiksasi, sampel direndam dalam alkohol 50 atau 70% dan diganti beberapa kali sebelum dilanjutkan pada tahap dehidrasi.

Proses berikutnya yaitu dehidrasi dengan etanol bertingkat, dehidrasi dimaksudkan agar kandungan air dalam sel hilang sepenuhnya. kemudian penjernihan dengan xilol. Pada tahap infiltrasi jaringan dimasukan dalam filtran, yaitu paraffin dan xilol dengan perbandingan 1:1. Tahap selanjutnya yaitu embeding. Paraffin dicetak dalam kotak yang terbuat dari kertas, kemudian organ diletakan didalamnya dengan posisi yang sesuai agar didapat hasil yang baik dalam penyayatan dengan mikrotom. Setelah disayat, spesimen diletakan diatas gelas objek yang telah diberi perekat berupa albumin setelah itu  gelas objek dipanaskan. Tahap selanjutnya adalah pewarnaan. Pada proses pewarnaan dilakukan deparafinasi dan rehidrasi. Rehidrasi dilakukan untuk mempersiapkan keadaan spesimen untuk proses pewarnaan dengan hematoksilin-eosin yang mengandung air. Kemudian dilakukan dehidrasi kembali untuk menghilangkan air dari spesimen.

Pada praktikum ini kami melakukan pewarnaan pada preparat yang telah disiapkan dan telah melewati proses penyiapan preparat dengan metode sediaan sayatan, preparat yang diamati yaitu preparat tyroid tikus dan testis katak. Pada tyroid tikus terlihat selnya berwarna merah dan berbentuk bulat, sedangkan testis katak berwarna merah keunguan dan berbentuk bulat.

Katak jantan memiliki sepasang testis yang berbentuk oval dan berwarna putih kekuning-kuningan. Testis berfungsi sebagai tempat pembentukan sel sperma. Sperma yang dihasilkan testis akan keluar menuju ginjal melalui saluran tempat bertemunya saluran kencing dan kelamin. Selanjutnya, sperma tersebut menuju kloaka. Kloaka merupakan tempat bertemunya tiga saluran , yaitu saluran kelamin, saluran kencing dan saluran pencernaan (Arisworo 2000).

KESIMPULAN

Metode sediaan sayatan merupakan metode yang lazim dan banyak digunakan dalam penyiapan preparat histologi. Dengan metode ini spesimen disayat setipis mungkin, diwarnai dan dijadikan spesimen yang dapat bertahan lama atau preparat awetan. Metode ini meliputi sejumlah proses diantaranya  fiksasi, dehidrasi, infiltrasi, penanaman dalam parafin, penyiapan parafin blok, penyayatan, pewarnaan dan penutupan specimen dengan kaca penutup. Proses fiksasi merupakan tahap yang penting, larutan fiksasi yang digunakn yaitu bouine. Setiap tahap dalam metode ini memiliki fungsinya masing-masing sehingga pada akhirnya dihasilkan preparat awetan yang baik untuk diamati dan dipelajari.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2009 .http://akuakulturunhas.com/2009/04/metode-parafin-untuk-histologi.html. [10 September 2009]

Anonim. 2009. http://monocotil.com/2009/07/preparat-melintang-dengan-metode.html. [10 September 2009]

Arisworo D dan yusa. 2000. General Zoologi. Jakarta: PT grafindo media pratama

Gunarso W. 1986. Pengaruh Dua Jenis Cairan Fiksatif  yang Berbeda pada Pembuatan Preparat dari Jaringan Hewan Dalam Metoda Mikroteknik Parafin. Bogor: IPB Press